Cheiro de baunilha no ar! Caracterização de enzimas envolvidas na conversão de ácido ferúlico em vanilina

Juscemácia Nascimento Araujo, egressa do Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência da UFABC, pesquisou, durante o doutorado, a caracterização biofísica e bioquímica de duas enzimas bacterianas envolvidas na conversão de ácido ferúlico em vanilina para entender a função e estrutura das enzimas feruloilCoA sintetases e feruloil-CoA hidratase/liase procarióticas.

A vanilina (aroma de baunilha) é um flavonoide de alto valor agregado, utilizado como flavorizante nas indústrias de alimentos e cosméticos. Uma das formas de obtê-la é pela biotransformação do ácido ferúlico em células bacterianas. Duas enzimas são responsáveis por esse processo: a feruloil CoA sintetase (FCS) e feruloil CoA hidratase/ liase (FCHL). Entender a estrutura e função dessas proteínas pode ajudar as indústrias que utilizam vanilina a produzi-la em biorreatores, barateando o custo da produção.

Juscemácia é doutora e mestre em Biotecnociência, bacharel em Química e Ciência e Tecnologia, todos pela Universidade Federal do ABC. Em sua carreira também cursou especialização em Docência do Ensino Profissional e Tecnológico pelo Instituto Federal de São Paulo (IFSP).

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Dados | Egressa

Nome completo
Juscemácia Nascimento Araujo

Formação acadêmica (cursos e instituições)
∙ Doutorado em Biotecnociência pela Universidade Federal do ABC (UFABC);
∙ Mestrado em Biotecnociência pela UFABC;
∙ Especialização em Docência do Ensino Profissional e Tecnológico pelo Instituto Federal de São Paulo (IFSP);
∙ Bacharelado em Química pela UFABC;
∙ Bacharelado em Ciência e Tecnologia pela UFABC.

Profissão / experiência profissional
Pesquisadora R&D Pleno - Pesquisa e desenvolvimento de solventes e formulações agroquímicas (formulação de pesticidas, biopesticidas e encapsulamento de ingredientes ativos).

Programa de pós-graduação e curso (mestrado ou doutorado) concluído na UFABC
Doutorado em Biotecnociência.

Como sua trajetória neste curso de pós-graduação na UFABC contribuiu para sua formação?
Pensamento crítico para organizar e fazer pesquisa científica, desenvolvimento de projetos, elaboração de planos de trabalho, conhecimento sobre química, nanotecnologia, bioquímica e caracterização biofísica de sistemas complexos. A interdisciplinaridade do curso favoreceu que eu consiga atuar em diversas áreas e ter a fluidez para migrar de um conteúdo/área de conhecimento a outro sem problemas, favoreceu a proatividade e liderança que apresento hoje.

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Dados | Dissertação

Título
Caracterização biofísica e bioquímica de duas enzimas bacterianas envolvidas na conversão de ácido ferúlico em vanilina

Data da defesa
3 de março de 2020

Nome do orientador
Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva

Linhas de pesquisa
Propriedades físicas, químicas e biológicas de moléculas complexas

Link para a dissertação

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Questões | Pesquisa

Qual o tema da sua pesquisa e por que o escolheu?
O ácido ferúlico é um dos compostos mais abundantes presentes na lignina. Além de ser uma molécula orgânica de alto valor agregado, pode ser ainda catabolizada em compostos como o eugenol e o álcool coniferil. É possível a biossíntese de vanilina pela via de ativação da feruloil-CoA e enoil-CoA utilizando as enzimas feruloil-CoA sintetases e enoil-CoA hidratase 6, 7, 8, 9. As feruloil-CoA sintetases são enzimas-chave por catalisarem a ativação de vários ácidos p-hidroxicinâmicos pela rota sintética de CoA-tioesterificação, com consumo de ATP 10,11,12

Atualmente, a grande maioria dos artigos científicos relacionados à biotransformação ou biocatálise de compostos fenólicos, como o ácido ferúlico em vanilina reportam o uso de feruloil-CoA sintetases, feruloil-CoA hidratase/liase e enoil-CoA hidratase. Entretanto, não existem trabalhos atuais que tenham caracterizados estruturalmente as enzimas feruloilCoA sintetases e feruloil-CoA hidratase/liase procarióticas. O objetivo principal foi entender a função e estrutura das enzimas feruloilCoA sintetases e feruloil-CoA hidratase/liase procarióticas.

Quais eram seus objetivos (gerais e específicos)?
O objetivo principal foi entender a função e estrutura das enzimas feruloilCoA sintetases e feruloil-CoA hidratase/liase procarióticas.

Como foi sua realização (materiais e métodos, metodologia, corpus etc.)?
1. Expressar FCS e FCHL em células de E. coli;
2. Purificar FCS e FCHL através de cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão por tamanho molecular;
3. Estudar a atividade enzimática da FCS (formação do complexo feruloil-CoA) variando-se o pH e temperatura;
4. Estudar mudanças conformacionais e a estabilidade térmica das FCS e FCHL usando espectroscopia de dicroísmo circular (CD);
5. Estudar mudanças conformacionais nas FCS e FCHL usando espectroscopia de fluorescência intrínseca;
6. Empregar a técnica de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) para estudar a forma e estado oligomérico das enzimas FCS e FCHL em solução;
7. Realizar ensaios de cristalização para obtenção de cristais das enzimas que difratem a alta resolução;
8. Determinar a estrutura cristalográfica de alta resolução das enzimas empregando a técnica de difração de raios X.

Quais foram os desafios enfrentados?
Obter um cristal de proteína. Desafio resolvido no último ano do doutorado ao realizar colaboração com pesquisadores da Unicamp e da USP.

Quais foram os principais resultados alcançados?
No processo de biotransformação são utilizadas enzimas responsáveis pelo processo da bioconversão de ácido ferúlico em vanilina, estas enzimas são: feruloil-CoA sintetase (FCS) e feruloil-CoA hidratase/liase (FCHL). A FCS possui 74, 92 kDa, atividade máxima em pH 7,8 e atividade específica de 30,75 ± 0,78 U/mg. A FCS apresenta Km de 0,1 mM, Vmax de 36,8 U/mg, kcat/km de 371,6 mM-1 .s-1 . A feruloil-CoA sintetase é um homodímero em solução com raio de giro (Rg) de 37,4 ± 0,5Å e diâmetro máximo (Dmax) de 128,5 Å e apresenta estrutura secundária do tipo α/β. A feruloil-CoA hidratase/liase possui 31, 32 kDa, teve sua estrutura cristalina determinada e apresenta ser um hexâmero em solução, um dímero de trímeros que é o conjunto típico, para a superfamília da crotonase com raio de giro de 34,3 Å, possui um diâmetro máximo de 94,2 Å, e sua estrutura secundária do tipo α/β, três α-hélices na região carboxi terminal que participa da oligomerização e uma região mais compacta composta de uma folha β e sete α-hélices.

Descreva, resumidamente, a importância acadêmica e social de sua pesquisa, isto é, sua contribuição para o universo científico e o cotidiano das pessoas.
Entender a estrutura e função de proteínas envolvidas na biotransformação de ácido ferúlico em vanilina pode ajudar as indústrias de alimentos, cosméticos, farmacêutica, entre outras que utilizam vanilina, a produzirem vanilina em biorreatores e obtê-la mais barato para o mercado.