Alternativa sustentável para a produção de biossurfactantes utilizando resíduo agroindustrial

A Revista Eletrônica PesquisABC possui o seguinte registro ISSN: 2675-1461

Luan Ratti Guassú [a],  Larissa Pereira Brumano [b]*.

[a] Discente de graduação do curso “Bacharelado em Ciência e Tecnologia (BC&T)” da Universidade Federal do ABC (UFABC). ORCID: https://orcid.org/0009-0005-0405-9514. 

[b] Docente do curso de graduação “Bacharelado em Biotecnologia” da Universidade Federal do ABC (UFABC) - Orientadora. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1135-4827. E-mail: Este endereço de email está sendo protegido de spambots. Você precisa do JavaScript ativado para vê-lo. 

Resumo: A crescente preocupação da sociedade e da comunidade científica com o meio ambiente tem impulsionado pesquisas inovadoras voltadas para o aproveitamento de resíduos e subprodutos agroindustriais na geração de produtos de alto valor agregado, como os biossurfactantes. Esses metabólitos microbianos apresentam propriedades físico-químicas relevantes, como tensoatividade e emulsificação, oferecendo uma alternativa aos surfactantes petroquímicos, com vantagens como baixa toxicidade, maior estabilidade e biodegradabilidade. Além disso, os biossurfactantes permitem o uso de matérias-primas renováveis, devido à sua origem biotecnológica. Neste contexto, investigou-se o crescimento celular e a produção de biossurfactantes utilizando a levedura Aureobasidium melanogenum CBMAI 1539, empregando glicerina residual da produção de biodiesel como substrato. Foram realizadas análises de concentração celular e da atividade surfactante em culturas utilizando glicerina residual, glicerol puro e sacarose como fontes de carbono. Os resultados deste estudo demonstraram um potencial promissor, sugerindo uma nova aplicação para a glicerina residual da produção de biodiesel na obtenção de biomoléculas de interesse ambiental.

Palavras-chave: Biossurfactantes; subprodutos agroindustriais; Biodiesel; Glicerina residual; Sustentabilidade; Biomoléculas.

Abstract: The growing concern of society and the scientific community about the environment has driven innovative research aimed at utilizing agro-industrial residues and by-products for generating high-value-added products, such as biosurfactants. These microbial metabolites exhibit significant physicochemical properties, including surface activity and emulsification, providing an alternative to petrochemical surfactants with benefits such as low toxicity, enhanced stability, and biodegradability. Additionally, biosurfactants facilitate the use of renewable raw materials due to their biotechnological origin. In this context, the growth and biosurfactant production using the yeast Aureobasidium melanogenum CBMAI 1539 were investigated, employing residual glycerol from biodiesel production as a substrate. Analyses of cell concentration and surfactant activity were conducted in cultures using residual glycerol, pure glycerol, and sucrose as carbon sources. The results of this study demonstrated promising potential, suggesting a novel application for residual glycerol from biodiesel production in the production of environmentally relevant biomolecules.

Keywords: Biosurfactants; Agro-industrial by-products; Biodiesel; Residual glycerol; Sustainability; Biomolecules.

Introdução

A interação homem-natureza é marcada atualmente pela exploração e dominação dos recursos naturais, culminando na degradação do meio ambiente 1 . O sistema de produção vigente, em particular o capitalista, não apenas intensifica essa degradação, como também contribui para o aumento dos resíduos poluentes. Com o agravamento dos problemas ambientais após a Segunda Guerra Mundial (1939 a 1945), a questão ambiental começou a ser debatida de forma mais ampla, incentivando mudanças significativas na percepção do mundo e na relação entre sociedade e consumo1. Esse questionamento levou a uma maior preocupação com a prevenção e reparação dos danos ambientais causados pelo progresso industrial no mundo moderno1,2.

Neste contexto, a Biotecnologia proporciona ferramentas inovadoras e essenciais para a demanda crescente por sociedades mais responsáveis ambientalmente, economicamente e socialmente, na busca do desenvolvimento sustentável, e por isso é estratégica para o cumprimento dos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável da Organização das Nações Unidas (ONU), apresentados na Agenda 2030 3.  

Processos biotecnológicos, também chamados de bioprocessos, têm a capacidade de produzir diversos produtos de interesse, desde biomoléculas simples como o etanol à complexas proteínas de alto valor agregado que podem ser utilizadas como biofármacos. Além disso, a utilização de células vivas e/ou suas enzimas possibilita a valorização eficiente de resíduos agroindustriais e facilita a degradação de poluentes, tornando-os ferramentas indispensáveis para a sustentabilidade ambiental.

Dentre as biomoléculas produzidas por via biotecnológica, os biossurfactantes se destacam por suas amplas aplicações industriais. Essas moléculas despertam interesse por serem alternativas aos surfactantes químicos disponíveis comercialmente produzidos em sua maioria a partir de derivados de petróleo4.  Os biossurfactantes, como glicolipídios, lipopeptídeos e poliolipídeos, têm aplicações em diversas indústrias, incluindo a química, cosmética e farmacêutica, além de serem auxiliares em processos de biorremediação 4.

Agentes surfactantes são moléculas que possuem partes hidrofílicas e hidrofóbicas, o que lhes confere a capacidade de distribuir-se em interfaces fluidas de diferentes polaridades (por exemplo água/óleo) e alterar a energia livre nessas interfaces, reduzindo a tensão superficial e interfacial. Por isso possuem ação detergente (devido à redução da tensoatividade) e emulsionante (geração de micelas), e são amplamente empregados na indústria química, cosmética, farmacêutica, entre outros. Também podem ser auxiliares em processos de biorremediação no caso de derramamentos de óleo, justamente por aumentarem a interação óleo/água e facilitar a ação de microrganismos que degradam o poluente em águas e solos 5.  As principais classes de biossurfactantes são os glicolipídios, lipopeptídeos e poliolipídeos6. 

As propriedades versáteis e as aplicações dos biossurfactantes, aliadas à crescente preocupação ambiental entre os consumidores e às novas legislações de controle ambiental, têm impulsionado a busca por fontes renováveis para a sua produção, como os resíduos industriais 7. No entanto, apesar de suas vantagens, os biossurfactantes ainda enfrentam desafios econômicos para competir com os surfactantes químicos no mercado devido aos custos associados à sua produção. Uma estratégia promissora para tornar a produção de biossurfactantes economicamente viável e reduzir os custos operacionais é a utilização de subprodutos industriais, como resíduos agroindustriais, gorduras e óleos8.

Muitos resíduos agrícolas e industriais possuem carbono e/ou nitrogênio em sua composição, e podem ser utilizados como nutrientes no cultivo de microrganismos9 . O glicerol, ou 1,2,3-propanotriol, é uma substância adocicada, liquida e viscosa, derivado de formas naturais ou petroquímica10. Sua utilização como um substrato alternativo aos açúcares tradicionais, tais como glicose, sacarose e amido são muito comuns, e por isso é um substrato promissor para produção de bioprodutos, como os biossurfactantes11. 

Durante a produção de biodiesel, aproximadamente 10% de glicerol é formado no processo de transesterificação. A eliminação do glicerol bruto é importante porque contém sal, ácidos graxos livres e metanol que causam contaminação do solo e criam desafios ambientais. No entanto, o custo excessivo do refino do glicerol bruto e a capacidade de mercado incentivam a pesquisa para o desenvolvimento de novas formas para utilizar o glicerol residual (também chamado de glicerina loira) 11.  A geração de glicerina é um desafio a ser enfrentado na produção de biodiesel. Uma vez que um grande volume é gerado, são envolvidos custos adicionais com seu processamento, despejo e estocagem, impactando assim no custo do processo de produção do biodiesel. Além disso, o excedente de glicerina associado à baixa demanda por este produto no mercado pode gerar um desequilíbrio econômico em usinas de biodiesel, levando assim à queda do preço desse subproduto e à estocagem do mesmo sem um destino certo 12. No entanto, com o intuito de evitar futuros problemas derivados da acumulação de glicerol e para tornar a produção de biodiesel mais competitiva, torna-se necessária a busca por alternativas para que novas tecnologias sejam criadas para a agregação de valor a este produto 12,13

O presente trabalho foi realizado na Universidade Federal do ABC (UFABC) e buscou avaliar se a produção de biossurfactantes, empregando um subproduto da produção de biodiesel, a glicerina loira, é possível. Como microrganismo produtor foi utilizada a levedura Aureobasidium melanogenum, sinônimo homotípico Aureobasidium pullulans var. melanogenum. Essa levedura já é descrita como produtora de biossurfactante do tipo poliol-lipídeo, chamado liamocina, que possui diversas aplicações biotecnológicas 10. Vale salientar que até o momento, não possui relatos na literatura da utilização da glicerina residual (glicerina loira) como fonte de carbono para a produção de biossurfactantes por essa levedura, o que destaca o caráter inovador do trabalho, além de reforçar a relevância tecnológica e ambiental desse tema.

Afinal, como é a levedura utilizada neste estudo?

Aureobasidium é um gênero de fungos do tipo “yeast-like” que pertencem ao filo Ascomycota, e são popularmente conhecidos como “black-yeasts” devido a sua capacidade de produzir melanina10. Até então, existem cerca de 38 espécies pertencentes ao gênero Aureobasidium, e veem sendo estudas amplamente ao longo do tempo14. Esta levedura é amplamente conhecida como fonte de polissacarídeo comercial pululana, usado como filme solúvel em água em aplicações alimentícias e farmacêuticas, bem como em outros bioprodutos valiosos, destacando assim, o seu grande potencial biotecnológico15.  

Em classificação, Aureobasidium pullulans foi caracterizado taxonomicamente com base em suas características morfológicas e nutricionais compreendendo uma única espécie com três variantes diferentes, como A. pullulans var pullulans, A. pullulans var. melanogenum, A. pullulans var. aubasidani 14,16.  No presente estudo, não foi adotado um critério específico de seleção em relação à variante escolhida, destacou-se exclusivamente o gênero e a classe da levedura (Aureobasidium pullulans) (Figura 1). A escolha dessa levedura se justifica não somente pela sua comprovada capacidade como produtora de biossurfactantes, mas também pela sua não patogenicidade e vantagens na configuração das condições operacionais e nutricionais necessárias para a viabilização do processo de produção em larga escala na indústria.

Figura 1 – Morfologia celular do Aureobasidium pullulans var. Melanogenum (Aumento 400x).

Fonte: Arquivo pessoal.

Metodologia 

Obtenção e caracterização da glicerina residual

A glicerina residual (glicerina loira) utilizada neste trabalho é subproduto do processo de produção do biodiesel e foi gentilmente cedida pela PETROBRAS/CENPES (Centro de Pesquisas Leopoldo Américo Miguez de Mello). Seu armazenamento foi feito em câmara fria, a 4 °C. A composição da glicerina residual fornecida pelo CENPES está apresentada na Tabela 1. 

Tabela 1 -  Composição da glicerina loira. Fonte: Centro de Pesquisas Leopoldo Américo Miguez de Mello (2020).

Reativação e preparado do inóculo

A levedura Aureobasidium melanogenum CBMAI 1539 foi mantida em estoque de glicerol (15% m/m) em ultrafreezer a -80 °C. A reativação da levedura foi realizada em placa de Pétri contendo meio YMA 17. O meio foi esterilizado em autoclave a 121 ºC por 15 min. Os repiques em meio YMA foram realizados de forma asséptica e incubados em estufa a 28 ºC por 72 h. 

O inóculo foi preparado em fracos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL do meio próprio para o cultivo de Aureobasidium melanogenum 17, usando sacarose 50 g/L como fonte de carbono 18,19. As soluções de reagentes foram autoclavadas a 121 ºC por 15 min, previamente à preparação do meio de cultivo. Os cultivos foram incubados à 28 ºC sob agitação de 200 rpm por 48 h. 

Avaliação de diferentes substratos como fonte de carbono 

Para avaliar a utilização da glicerina residual como fonte de carbono para a produção de biossurfactante pela levedura, foram analisados e comparados o crescimento celular e a atividade surfactante obtidos em cultivos utilizando glicerina residual, glicerol P.A. (controle) e sacarose (meio padrão da literatura). Os ensaios foram realizados em triplicata utilizando 50 g/L de cada fonte de carbono no meio base 20 17. As amostras foram coletadas a cada 24h para análise da concentração celular e atividade tensoativa. Os cultivos foram realizados em duplicata.

Métodos analíticos

- Concentração celular

A concentração celular foi estimada utilizando a densidade óptica por espalhamento da luz a 600 nm (DO600), por meio de um espectrofotômetro UV/VIS (Molecular Dvices, Spectra Max Plus 384). A partir da leitura dos resultados da densidade óptica (DO) foi construído um gráfico do crescimento celular ao longo do tempo de cultivo.

- Atividade surfactante (teste do espalhamento da gota)

A atividade surfactante (tensoativa) foi determinada utilizando o método de espalhamento da gota 21. A presença de biossurfactante foi confirmada com o espalhamento da gota abrindo um halo sobre o óleo. A atividade tensoativa do biossurfactante produzido foi medida pelo diâmetro da zona de abertura do halo (cm). O valor desse diâmetro está relacionado com a concentração de biossurfactante presente no meio. O controle negativo foi realizado utilizando 10 μL de meio de cultivo não inoculado. O teste foi realizado em duplicata. 

Resultados e discussão

Entre as fontes de carbono investigadas, incluíram-se a sacarose, o glicerol P.A. e o glicerol residual. A sacarose é a fonte de carbono frequentemente utilizada para cultivos com Aureobasidium, o que torna sua escolha especialmente relevante, pois facilita a compreensão e a possibilidade de discussão para comparação em fontes alternativas, dada sua ampla utilização e aplicação em trabalhos científicos anteriores18,19.

O cultivo utilizando as diferentes fontes de carbono forneceu uma observação qualitativa das modificações ocorridas quanto ao aspecto do cultivo, o crescimento celular relacionado ao adequado consumo das fontes de carbono e a produção de biossurfactante (pela atividade tensoativa observada). As identificações observadas se dão em função de aspectos do meio de cultivo, que se manifestaram tanto na mudança de cor como na variação de viscosidade. O aumento da viscosidade pode ser explicado pela coprodução de pululana, um exopolissacarídeo. A mudança da cor está relacionada à produção de pigmentos com tonalidades pretas, marrons e verdes, sendo a melanina o pigmento predominante 18,19(Figura 2) . 

Figura 2 - Mudança de coloração do cultivo de Aureobasidium melanogenum CBMAI 1539 após 168 h de cultivo em diferentes fontes de carbono (Sacarose, Glicerol P.A. e Glicerol residual). Frascos 1 e 2: Sacarose, Frascos 3 e 4: glicerol P.A., Frascos 5 e 6: glicerol residual. Fonte: Arquivo pessoal.

Pode-se observar que os cultivos com sacarose apresentaram maior intensidade amarelada, enquanto os cultivos com glicerol apresentaram pigmentação mais enegrecida, de maior ou menor intensidade. Esses resultados destacam como a escolha da fonte de carbono e condições de processo impactam nos tipos de metabolitos produzidos pela levedura, como por exemplo a melanina 18,23.

O crescimento celular e a tensoatividade observadas nos diferentes cultivos são apresentados nas Figuras 3 e 4. É possível observar que há uma relação entre o aumento da absorbância (que indica crescimento celular) e a tensoatividade. De acordo com os resultados, a levedura foi capaz de crescer nas três fontes de carbono testadas, incluindo o glicerol residual. 

Figura 3 – Densidade óptica ao longo do tempo de cultivo em diferentes fontes de carbono (Sacarose, Glicerol P.A e Glicerol residual). Fonte: Arquivo pessoal.

Figura 4 – Atividade surfactante ao longo do tempo de cultivo em diferentes fontes de carbono (Sacarose, Glicerol P.A e Glicerol residual). Fonte: Arquivo pessoal.

O maior crescimento foi observado no cultivo utilizando sacarose como fonte de carbono. Este resultado era esperado, uma vez que esta é a fonte de carbono preferencialmente utilizada por A. pullulans24. Comparando os cultivos utilizando glicerol P.A. e glicerol residual, foi observado que a levedura cresceu de forma semelhante (sem diferença significativa) (Figura 3), e obteve uma tensoatividade significativa comparado com o glicerol PA, fonte de carbono convencional utilizada na literatura (figura 4). Esses resultados indicam que os demais componentes presentes no glicerol residual, como metanol e sais, resultantes do processo de transesterificação do biodiesel11 não afetaram a levedura, sugerindo a tolerância da levedura. Este é um importante resultado, indicando a viabilidade do uso do glicerol residual no bioprocesso na concentração testada no trabalho, promovendo assim, uma alternativa para aplicação biotecnológica, destacadamente para a produção de biossurfactante 11.

Conclusão

A levedura Aureobasidium melanogenum CBMAI 1539 apresentou tolerância e capacidade de crescimento utilizando o glicerol residual como fonte de carbono. Esta fonte de carbono renovável e sustentável também apresentou resultados positivos para a produção de biossurfactantes pela levedura, superando os resultados obtidos utilizando glicerol puro. Assim, trabalho permitiu maior compreensão a respeito do comportamento do microrganismo nas diferentes fontes de carbono e utilização do glicerol residual no processo. 

Para a indústria biotecnológica, a utilização do glicerol residual como insumo para a produção de biossurfactantes oferece uma oportunidade significativa de reduzir custos de produção e melhorar a sustentabilidade dos processos industriais. Como biossurfactantes têm uma ampla gama de aplicações, a adoção do glicerol residual como fonte de carbono, pode contribuir para a redução de impactos ambientais, como a redução da utilização de petroquímicos.

Além disso, o desenvolvimento de políticas de sustentabilidade que incentivem a pesquisa e o uso de subprodutos, aceleraram a transição para processos industriais mais ecológicos. Isso inclui subsídios para pesquisas em biotecnologia sustentável e incentivos fiscais para empresas que adotam práticas de economia circular.

Este estudo desenvolvido no âmbito de um projeto Pesquisando Desde o Primeiro dia (PDPD), apoiado pela Universidade Federal do ABC (UFABC) trouxe resultados inovadores e abre perspectivas para trabalhos futuros para um processo mais sustentável de produção de biossurfactantes, com implicações significativas para diversas aplicações biotecnológicas e ambientais. 

Trabalhos futuros visando a otimização e ampliação de escala do bioprocesso, purificação, caracterização e testes de aplicação do biossurfactante produzido serão importantes para a viabilidade técnica e econômica e assegurar a eficácia do biossurfactante em aplicações práticas. Além disso, o estudo mais aprofundado do impacto ambiental do biossurfactante e de seu processo de produção ajudará a avaliar a sustentabilidade geral da solução.  Esses trabalhos futuros são fundamentais para transformar os resultados de pesquisa em soluções práticas e viáveis, beneficiando a indústria biotecnológica e a sociedade, e contribuindo para práticas mais sustentáveis e inovadoras.

 Referências

1. De Oliveira, T. F. Obtenção de biossurfatante com propriedades antimicrobiana e antibiofilme a partir de resíduos industriais. (Universidade de são Paulo, São Paulo, 2021).

2. Peneluc, M. D. C. Pandemia de Covid-19 e destruição da natureza: uma crítica baseada no marxismo ecológico. Voluntas: Revista Internacional de Filosofia 11, e39 (2020).

3. Organização das Nações Unidas. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. A/RES/70/1 41 https://sdgs.un.org/sites/default/files/publications/21252030 Agenda for Sustainable Development web.pdf (2015).

4. Marinho, P. S. da S., Silva, R. R. da & Luna, J. M. de. Biossurfactantes microbianos e aplicações ambientais: uma revisão narrativa. Research, Society and Development 11, e103111234123 (2022).

5. Nitschke, M. & Pastore, G. M. Biossurfactantes: propriedades e aplicações. Quim Nova 25, 772–776 (2002).

6. Bezerra, K. G. O., Rufino, R. D., Luna, J. M. & Sarubbo, L. A. Saponins and microbial biosurfactants: Potential raw materials for the formulation of cosmetics. Biotechnol Prog 34, 1482–1493 (2018).

7. Sarubbo, L. A. et al. Biosurfactants: Production, properties, applications, trends, and general perspectives. Biochem Eng J 181, 108377 (2022).

8. Kanwal, M. et al. Advancements and challenges in production of biosurfactants. in Applications of Next Generation Biosurfactants in the Food Sector 239–259 (Elsevier, 2023). doi:10.1016/B978-0-12-824283-4.00019-8.

9. Nnolim, N. E., Okoh, A. I. & Nwodo, U. U. Proteolytic bacteria isolated from agro-waste dumpsites produced keratinolytic enzymes. Biotechnology Reports 27, e00483 (2020).

10. Mota, C. J. A., Silva, C. X. A. da & Gonçalves, V. L. C. Gliceroquímica: novos produtos e processos a partir da glicerina de produção de biodiesel. Quim Nova 32, 639–648 (2009).

11. Chilakamarry, C. R., Sakinah, A. M. M., Zularisam, A. W. & Pandey, A. Glycerol waste to value added products and its potential applications. Systems Microbiology and Biomanufacturing 1, 378–396 (2021).

12. De Sousa, M. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA MARYLANE DE SOUSA BIOCONVERSÃO DO GLICEROL PARA PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES: APLICAÇÃO NO PREPARO DE EMULSÕES FORTALEZA-CE 2011. http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/15890 (2011).

13. Raza, M., Inayat, A. & Abu-Jdayil, B. Crude Glycerol as a Potential Feedstock for Future Energy via Thermochemical Conversion Processes: A Review. Sustainability 13, 12813 (2021).

14. Zalar, P. et al. Redefinition of Aureobasidium pullulans and its varieties. Stud Mycol 61, 21–38 (2008).

15. Kang, X.-X. et al. Liamocins biosynthesis, its regulation in Aureobasidium spp., and their bioactivities. Crit Rev Biotechnol 42, 93–105 (2022).

16. Yurlova, N. A. & de Hoog, G. S. A new variety of Aureobasidium pullulans characterized by exopolysaccharide structure, nutritional physiology and molecular features. Antonie Van Leeuwenhoek 72, 141–7 (1997).

17. Saika, A. et al. Screening and isolation of the liamocin-producing yeast Aureobasidium melanogenum using xylose as the sole carbon source. J Biosci Bioeng 129, 428–434 (2020).

18. Manitchotpisit, P., Price, N. P. J., Leathers, T. D. & Punnapayak, H. Heavy oils produced by Aureobasidium pullulans. Biotechnol Lett 33, 1151–1157 (2011).

19. Brumano, L. P. et al. Biosurfactant production by Aureobasidium pullulans in stirred tank bioreactor: New approach to understand the influence of important variables in the process. Bioresour Technol 243, 264–272 (2017).

20. Manitchotpisit, P. et al. Aureobasidium pullulans as a source of liamocins (heavy oils) with anticancer activity. World J Microbiol Biotechnol 30, 2199–2204 (2014).

21. Morikawa, M., Hirata, Y. & Imanaka, T. A study on the structure–function relationship of lipopeptide biosurfactants. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 1488, 211–218 (2000).

22. Pereira Brumano, L. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA. (2017).

23. Leathers, T. D., Price, N. P. J., Bischoff, K. M., Manitchotpisit, P. & Skory, C. D. Production of novel types of antibacterial liamocins by diverse strains of Aureobasidium pullulans grown on different culture media. Biotechnol Lett 37, 2075–2081 (2015).

24. Sheng, L., Tong, Q. & Ma, M. Why sucrose is the most suitable substrate for pullulan fermentation by Aureobasidium pullulans CGMCC1234? Enzyme Microb Technol 92, 49–55 (2016).